Kreitz, J., Friedrich, M.J., Guru, A. et al. Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system. Nature 616, 357–364 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7
1. 執行摘要
本報告旨在總結一項開創性研究，該研究成功將光桿菌毒力盒（Photorhabdus virulence cassettes, PVCs）——一種細胞外收縮注射系統（extracellular contractile injection systems, eCISs）——工程化為一個高度可編程的平台，用於將蛋白質精準遞送至真核細胞，包括人類細胞和活體小鼠 1。
該研究解決了多項關鍵問題：過去對 eCISs 在人類細胞中的功能知之甚少，且其靶細胞識別機制亦不明確 1。此外，將這些系統應用於治療需要克服其在靶向特異性和酬載多樣性方面的局限性 1。
本研究的核心創新在於：證明了透過工程改造 PVC 的尾纖維（Pvc13）可以重新編程其靶向特異性；發現了利用 N 端包裝域裝載多樣化非天然蛋白質酬載的方法；並在昆蟲細胞、人類細胞、原代細胞以及活體小鼠等多種環境中驗證了其功能性遞送能力 1。這些成就預示著 PVCs 作為一種多功能且精準的遞送工具，在基因療法、癌症療法和生物防治等領域具有廣闊的應用前景，有望成為現有遞送技術的有力替代品。
2. 引言：可編程蛋白質遞送的潛力
內共生細菌已演化出精密的遞送系統，使其能夠與宿主生物學進行交互作用。其中一個顯著例子是收縮注射系統（contractile injection systems, CISs），這類注射器狀的巨分子複合體類似於噬菌體尾部，能夠將蛋白質酬載注入真核細胞，透過將尖刺穿透細胞膜來實現 1。在這些系統中，細胞外收縮注射系統（eCISs）作為獨立的複合體被產生並釋放至細胞外，從而獨立於細菌生產者進行酬載遞送 1。eCISs 的酬載已被證明具有多種天然功能，包括調節宿主細胞骨架、DNA 切割、誘導變態以及宿主毒性，這表明這些系統已適應了多種生物生態位 1。
儘管先前的研究已發現 eCISs 能夠靶向小鼠細胞，暗示了其在蛋白質遞送工具方面的潛在應用 1。然而，將 eCISs 轉化為人類治療應用仍面臨重大挑戰。首先，eCISs 在人類細胞中的活性尚未得到證實，這限制了它們在人類治療中的潛力 1。其次，這些系統如何識別靶細胞的機制尚不清楚，而這對於開發靶向遞送裝置至關重要 1。
本研究透過深入探討來自昆蟲病原體光桿菌（Photorhabdus asymbiotica）的 PVCs，成功解決了這些關鍵的未知問題，並展示了其在靶向蛋白質遞送方面的可編程性 1。這項研究的意義在於，它將一個自然演化而來的細菌系統，透過精密的工程改造，轉化為一種適用於人類治療的工具。eCISs 作為天然的蛋白質注射器，其在自然界中已展現出多樣化的功能，例如毒性和宿主調節 1。然而，將這種針對特定宿主（如昆蟲）演化而來的系統，重新編程以適應人類應用，並使其具備精準的靶向性和多樣的酬載能力，是這項研究的核心挑戰。本研究成功填補了 eCISs 在人類細胞中的功能未知以及其靶向機制不明確的科學空白 1。這項工作不僅是生物技術領域的一個里程碑，更體現了從自然生物系統（如細菌分泌系統或 CRISPR-Cas）中汲取靈感，並透過複雜工程改造以實現新型治療應用的趨勢。它強調了從天然微生物組中進行生物探索，以開發先進遞送平台的巨大潛力，這超越了傳統的病毒或脂質奈米顆粒方法。本研究的成功為探索其他 eCIS 亞家族或類似的天然奈米機器開闢了新的途徑，以滿足多樣化的生物技術需求。
3. 光桿菌毒力盒 (PVC)：結構與工程化生產
PVC 是一種 eCIS，由光桿菌屬（Photorhabdus）成員產生，這些細菌作為昆蟲病原線蟲的內共生體存在 1。PVC 是一個注射器狀的巨分子複合體，由一個剛性內管結構組成，該結構被包裹在一個可收縮的鞘中，並錨定在一個基板上，尖端帶有一個尖刺蛋白 1。PVC 的操縱子約 20 kb，包含 16 個核心基因（pvc1-16），這些基因對於組裝一個功能性注射系統至關重要 1。在 pvc1-16 的下游，是酬載基因 Pdp1 和 Pnf 1。在天然宿主中，PVC 透過尾纖維（Pvc13）識別靶細胞，隨後鞘收縮，將尖刺驅動穿透細胞膜。酬載蛋白質被認為裝載在內管腔中，位於尖刺後方，並透過尖刺-管複合體的解體進入細胞 1。
為了在實驗室中生產 PVCs 並進行操作，研究人員將 PVC 系統分為兩個獨立的質體，並將其轉化到大腸桿菌中進行生產：一個是結構和輔助質體（pPVC），包含 pvc1-16 基因；另一個是酬載和調節質體（pPayload），包含酬載基因 Pdp1 和 Pnf 以及一些推測參與基因調控的基因 1。透過負染色透射電子顯微鏡（TEM）觀察，純化後的蛋白質複合體與典型的 eCISs 相似，具有完整的基板和鞘結構，長度約為 116 nm，證明了其正確的組裝 1。值得注意的是，研究發現 pPayload 質體對於產生可檢測的 PVC 顆粒是必需的，這表明酬載區域中標記為橙色的小基因（圖 1a）對於大腸桿菌中 PVC 的形成至關重要 1。當這些純化的複合體短暫暴露於培養的 Sf9 昆蟲細胞時，它們能夠穩健地結合到細胞表面，進一步證實了正確的組裝和靶向能力 1。
這項發現揭示了複雜複合體組裝的微妙之處，這對於可擴展生產至關重要。儘管 qPCR 和蛋白質印跡分析顯示，即使沒有 pPayload 質體，結構性 PVC 組件的 mRNA 和蛋白質水平仍然存在，但卻無法檢測到組裝完整的 PVC 顆粒。這表明 pPayload 質體中的基因不僅僅影響酬載，更在 PVC 的組裝過程中扮演著關鍵角色。這類基因可能編碼分子伴侶、支架蛋白，或參與 PVC 組件的翻譯後摺疊或複合體形成。這種作用比簡單的轉錄調控更為精細和複雜。對於治療用途的 PVCs 的工業化或大規模生產而言，理解並優化這個組裝過程至關重要。這意味著僅僅表達結構基因是不夠的；這些「組裝輔助」基因也必須共同表達，並可能需要優化以實現高產量和高品質。這項發現為未來複雜蛋白質奈米機器的生物製造提供了關鍵的設計原則，突出了瓶頸可能不是蛋白質合成，而是它們正確組裝成功能單元。這也為進一步研究這些細菌組裝因子的精確分子機制開闢了途徑。
4. PVCs 的可編程靶向與酬載遞送工程
透過 Pvc13（尾纖維）重新編程靶向特異性
研究人員假設 PVC 的尾纖維蛋白（Pvc13）是決定其趨向性的關鍵元素，這與噬菌體尾纖維的功能相似 1。Pvc13 基因包含一個預測的結構域，該結構域與噬菌體 T4 短尾纖維的受體結合尖端相似。此外，PVC 尾纖維還常包含與真核病毒（特別是腺病毒）受體結合蛋白相關的區域，這支持了其參與真核生物識別的假設 1。Pvc13 還被觀察到以與噬菌體相似的方式連接到基板並沿著鞘向上摺疊，進一步強化了其在靶識別中的作用 1。
為了引導工程改造，研究人員利用 AlphaFold 預測了 Pvc13 假定遠端尖端（C-末端，氨基酸 403-476）的三維結構，該區域被推測會與靶細胞進行初步接觸 1。當以三聚體形式建模時，Pvc13 的 C-末端形成一個預測的螺旋管結構，其一端帶有一個球狀尖端，被認為是整個尾纖維的結合域 1。
基於這些結構預測，研究人員透過插入新型結合域來改變 Pvc13 遠端結合域的結合特性，以實現對人類細胞的靶向。他們使用了兩種特定於人類細胞的結合域：來自人類腺病毒 5 (Ad5) 的三聚體結節域（產生 Pvc13-Ad5-knob）和表皮生長因子受體 (EGFR) 特異性設計型錨蛋白重複蛋白 (DARPin) E01（產生 Pvc13-E01-DARPin）1。這些工程化的 PVCs 在 A549 人類肺腺癌細胞上進行了測試，這些細胞已知過度表達 EGFR 並對 Ad5 感染敏感。結果顯示，裝載有天然毒素 Pdp1 和 Pnf 的 Pvc13-Ad5-knob 或 Pvc13-E01-DARPin 能夠有效地殺死 A549 細胞，或在 A549 loxP-GFP 細胞中產生高效的 Cre 驅動 GFP 表達 1。值得注意的是，當 PVCs 配備突變的 Ad5 結節域（Δ491/492，先前已證明會降低 Ad5 與靶細胞的結合）或非靶向 DARPin（抗溶菌酶 DARPin A4）時，這種活性被消除，這證實了 PVC 在人類細胞中的活性取決於能夠正確結合人類細胞的尾纖維 1。結合實驗還顯示，攜帶 Pvc13-Ad5-knob 或 Pvc13-E01-DARPin 的 PVCs 在人類細胞表面聚集，表明觀察到的活性是工程化 PVCs 與靶細胞之間新型結合相互作用的結果 1。
為了靶向小鼠細胞，研究人員再次利用 AlphaFold 引導 Pvc13 的工程改造 1。他們篩選了兩個新的結合域：一個是修飾的 Ad5 結節域（Ad5-knob(RGD/PK7)），該變體先前已用於擴展 Ad5 對小鼠組織的宿主範圍；另一個是靶向小鼠 MHC II 類蛋白的奈米抗體（anti-MHCII Nb）1。裝備這些新結合域的 PVCs 在小鼠細胞系和原代細胞中顯示出顯著增強的活性 1。攜帶 Ad5-knob(RGD/PK7) 的 PVCs 表現出廣泛的趨向性，而靶向 MHC II 類蛋白的 PVCs 則對 MHC 免疫細胞表現出強烈的偏好，這進一步證明了 PVC 活性取決於合適靶受體的出現 1。
這項研究透過 AlphaFold 預測 Pvc13 結合尖端的結構，並插入多樣化的已知結合域（如 Ad5 結節域、DARPins 和奈米抗體），成功地將 PVCs 重新定向到特定的人類和小鼠細胞 1。這不僅僅是「找到一個靶點」，更展示了一種模組化和合理設計的原則。透過識別 Pvc13 作為關鍵的趨向性決定因素並理解其結構，研究人員現在可以「即插即用」不同的結合基序。這種模組化意味著，如果針對某種疾病識別出新的細胞表面標誌物，相應的結合蛋白就有可能被工程化到 Pvc13 中，從而創建一個新的靶向 PVC。AlphaFold 的應用作為現代計算生物學的進步，加速了這種合理設計的過程。這種模組化相較於許多傳統的基因/蛋白質遞送系統具有關鍵優勢，因為後者通常缺乏如此精細和易於適應的靶向能力。這預示著未來 PVCs 可以針對新興的治療靶點（包括特定的癌症亞型、免疫細胞，甚至病原體感染的細胞）進行快速客製化。這種方法有望顯著縮短新靶向療法的開發時間，並實現高度個人化的醫療。同時，它也驗證了計算結構生物學（如 AlphaFold）在加速生物工程方面的強大能力。
裝載多樣化蛋白質酬載
為了將 PVCs 開發成可編程的蛋白質遞送裝置，研究人員首先嘗試將新型的非天然酬載裝載到 PVC 中 1。雖然 PVC 招募酬載的機制尚未完全理解，但最近的研究表明，內源性 PVC 酬載蛋白質（Pdp1 和 Pnf）N 末端的高度無序區域參與了裝載過程 1。研究人員證實，缺乏此無序區域的修飾酬載無法裝載到 PVCs 中，這表明該區域代表了將酬載裝載到 PVC 複合體中所需的「包裝域」1。
因此，他們將此包裝域融合到各種非天然裝載到 PVC 中的蛋白質上，例如 GFP、Cre 和鋅指核酸酶，並測試了所得的工程化酬載是否能裝載到 PVCs 中 1。結果發現，在 Pvc15（一種 ATPase，也被證明對酬載裝載是必需的）存在下，所有三種新型酬載都能與 PVCs 共純化，這證實了這種方法（N-末端融合包裝域）是將新型蛋白質裝載到 PVC 顆粒中的通用策略 1。PVCs 能夠裝載多種酬載，包括 Cas9，其分子量（170 kDa）遠大於 PVCs 天然裝載的酬載（Pdp1 和 Pnf，均為 37 kDa），這證明了 PVCs 能夠遞送不同大小的多樣化酬載 1。
N 端「包裝域」的發現是酬載多功能性的關鍵。內源性酬載（Pdp1 和 Pnf）N 端的高度無序區域被證明是裝載所必需且充分的，並且該策略成功應用於多種非天然蛋白質（GFP、Cre、Cas9、鋅指核酸酶）1。這項發現為系統的酬載端提供了一個關鍵的「即插即用」機制，與靶向元素的模組化相呼應。這意味著 PVC 系統不再局限於其天然毒素，而可以成為一種通用的蛋白質遞送載體。能夠裝載 Cas9 這樣的大分子蛋白質（170 kDa）尤其重要，因為許多其他遞送方法在處理大分子貨物時會遇到困難。這種「無序區域」的特性表明酬載的識別和整合具有靈活性，可能適應各種蛋白質結構。這種「通用包裝域」的概念將 PVCs 從一種專門的細菌武器轉變為一種高度適應性的生物技術工具。它消除了治療開發的一個主要障礙，因為這意味著幾乎任何治療性蛋白質（酶、抗體、轉錄因子、核酸酶）都有可能被遞送。這極大地擴展了 PVCs 的治療前景，使其在與現有蛋白質遞送方法（通常具有尺寸或貨物限制）的競爭中更具優勢。這也指出了巨分子機器如何識別和裝載特定貨物的一個基本生物學原理。
5. 人類細胞中的功能性驗證
研究人員首先在培養的昆蟲細胞中直接觀察了 PVC 介導的蛋白質遞送。將含有天然毒素酬載的未經修飾的 PVCs 與 Sf9 細胞孵育後，觀察到顯著的細胞毒性 1。值得注意的是，這種表型需要幾個關鍵 PVC 基因的存在，包括推測的靶向元素（pvc13，編碼尾纖維）和先前被認為是酬載裝載器（pvc15）的基因 1。此外，單獨純化的酬載或未裝載的 PVC 複合體不足以重現這種表型，這表明觀察到的活性需要 PVC 複合體和毒素酬載的共同作用 1。此外，當將人工裝載 Cre 的 PVCs（使用圖 1e 中描述的方法）施用於含有 Cre 報告系統（loxP-GFP）的 Sf9 細胞時，產生了 GFP 信號，這證明了新型蛋白質酬載可以透過 PVC 進行功能性遞送 1。
為了在人類細胞中建立多種有用的遞送應用，研究人員進一步擴展了研究。
毒素遞送與特異性細胞毒性：
將裝載有天然毒素（Pdp1 和 Pnf）的 PVCs 重新靶向至 T 細胞受體（CD4）特異性的 DARPin，結果在 Jurkat 細胞（T 細胞白血病細胞系）中產生了高效的細胞毒性 1。
此活性具有受體特異性：靶向 Jurkat 細胞不表達的髓系受體（CD11b）的 PVCs 導致細胞死亡微不足道 1。這表明 PVC 介導的人類癌細胞細胞毒性是受體特異性的。
透過掃描電子顯微鏡（SEM）和免疫螢光的高解析度成像證實，EGFR 特異性 PVCs 結合到 A549 細胞並誘導 F-肌動蛋白凝結，這表明內源性 PVC 毒素酬載（已知靶向肌動蛋白細胞骨架）已成功遞送 1。
Cas9 的功能性遞送以實現基因編輯：
研究人員測試了重新編程的 PVCs 是否能遞送化膿性鏈球菌 Cas9（SpCas9）蛋白以在人類細胞中進行基因編輯 1。
將帶有 Pvc13-Ad5-knob（人類細胞特異性新型結合域）的 PVCs 裝載 Cas9，所得顆粒在含有引導 RNA 的 HEK 293FT 細胞中產生了靶向插入和缺失（indels）1。
這項實驗意義重大，因為 Cas9（Pdp1-NTD-Cas9 為 170 kDa）遠大於 PVCs 天然裝載的酬載（Pdp1 和 Pnf 為 37 kDa），證明了 PVCs 能夠遞送不同大小的多樣化酬載 1。
插入和缺失的形成需要 Pvc13 中存在未突變的 Ad5 結節域，這證實了基因編輯活性是由 PVC 的特異性靶向機制介導的 1。
鋅指脫胺酶（ZFDs）的功能性遞送以實現鹼基編輯：
為實現無引導 RNA 的基因編輯，研究人員嘗試遞送鋅指脫胺酶（ZFDs），這是一種由鋅指域與分裂脫胺酶連接而成的系統 1。
當帶有 Pvc13-Ad5-knob 的 PVCs 裝載 ZFD-L 或 ZFD-R（靶向人類 TRAC 基因座的 ZFD 的左右臂）並共同施用於 HEK 293FT 細胞時，觀察到靶向 G 到 A 的鹼基替換 1。
這表明 PVCs 能夠遞送 ZFDs 以在人類細胞中進行鹼基編輯。非靶向 PVCs 活性微不足道，進一步強調了正確靶向的必要性 1。
這項研究不僅展示了蛋白質被遞送，更重要的是，它們在靶細胞內保持功能活性，導致特定的細胞毒性、GFP 表達、基因插入/缺失和鹼基替換 1。功能驗證是任何遞送系統的黃金標準，它證實了酬載在包裝、注射和細胞內釋放後仍保持活性，並且細胞機制能夠利用它。功能結果的多樣性（細胞死亡、報告基因表達、精確基因組編輯）展示了 PVC 系統的廣泛效用和精準性。針對癌細胞的受體特異性殺傷對於治療轉化尤為重要，它展示了一個關鍵的安全特性。這種功能性證明將 PVCs 從單純的科學好奇心轉變為治療開發的可行平台。這表明 PVCs 可用於需要精確細胞結果的高度靶向療法，例如在不傷害健康細胞的情況下消除特定的癌細胞，或以高保真度糾正基因突變。實現無引導 RNA 的鹼基編輯是一項尖端應用，它簡化了基因編輯協議，並減少了與引導 RNA 相關的潛在脫靶效應。這種水平的功能驗證對於吸引投資和加速臨床前開發至關重要。
6. 小鼠模型中的體內功效與安全性
為了評估 PVCs 在活體生物體中的潛在應用，研究人員進一步在小鼠模型中進行了體內蛋白質遞送實驗 1。透過 AlphaFold 引導的 Pvc13（尾纖維）工程改造，成功開發出能夠靶向小鼠細胞的 PVC 變體 1。他們篩選了兩種新的結合域：一種是修飾的 Ad5 結節域（Ad5-knob(RGD/PK7)），該域先前已被用於擴展 Ad5 對小鼠組織的宿主範圍；另一種是靶向小鼠 MHC II 類蛋白的奈米抗體 1。將 Pvc13 裝備這些新結合域後，所得的 PVCs 在小鼠細胞系和原代細胞中顯示出顯著增強的活性 1。值得注意的是，雖然重新靶向 Ad5-knob(RGD/PK7) 的 PVCs 表現出廣泛的趨向性，但靶向 MHC II 類蛋白的 PVCs 則對 MHC 免疫細胞表現出強烈偏好，這進一步證明了 PVC 活性取決於合適靶受體的出現 1。
將 Cre 裝載到攜帶 Pvc13-Ad5-knob(RGD/PK7) 的 PVCs 中，並在 loxP-tdTomato 報告小鼠中進行顱內注射 1。作為陰性對照，另一些小鼠被注射了缺少尖刺尖端（Pvc10）的類似 PVCs，該蛋白在體外實驗中被發現對於 PVC 介導的遞送是必需的 1。顱內注射 Pvc13-Ad5-knob(RGD/PK7) 顆粒後，在海馬體中觀察到 Cre 介導的 tdTomato 表達，表明 PVCs 在體內具有活性 1。
為了評估細胞靶向性，從處理過的大腦中提取單細胞懸液，並透過流式細胞術量化神經元和小膠質細胞中的 tdTomato 信號 1。結果顯示，神經元中 tdTomato 信號顯著富集，而小膠質細胞中則沒有，這表明攜帶 Pvc13-Ad5-knob(RGD/PK7) 的 PVCs 能夠在體內靶向神經元 1。此結果在體外針對原代神經元也得到了證實 1。
在安全性方面，研究發現完整的 PVCs 可以在處理過的大腦中於 0 或 1 天時輕鬆純化，但在 7 天後則無法檢測到 1。這表明 PVCs 在大腦中是暫時性的，不會長時間存在，這暗示該系統非常適合需要暫時性或短期作用的療法 1。此外，PVC 治療並未引起任何顯著的免疫細胞激活、炎症細胞因子產生、體重減輕或細胞毒性 1。這表明 PVC 治療在實驗時間內不具有免疫原性或毒性 1。
這些體內研究結果是臨床轉化的關鍵一步。缺乏免疫原性和毒性是 PVCs 相較於許多病毒載體（如 AAV、腺病毒）的一個主要優勢，後者通常會引起強烈的免疫反應，限制重複給藥或導致不良反應。PVCs 的暫時性則是一把雙刃劍：它非常適合需要暫時性作用的療法（例如急性炎症、暫時性基因編輯），但對於慢性疾病可能需要重複給藥，而其非免疫原性特徵將有助於此。特別是神經元靶向性，為神經系統疾病這一難以遞送的廣闊治療領域開闢了道路。這些體內發現對於臨床前開發至關重要。它們預示著一個潛在更安全、更可控的遞送平台，解決了監管批准和患者安全方面的關鍵問題。暫時性可以被利用於「按需」療法或減輕長期脫靶效應。低免疫原性意味著重複給藥的可能性，這對於慢性疾病或優化治療窗口至關重要。這使得 PVCs 在神經系統基因療法以及其他免疫反應是限制因素的應用中極具競爭力。
7. PVC 遞送的特異性與受體依賴性
本研究旨在探討 PVCs 是否像噬菌體一樣，表現出高度的靶點特異性，噬菌體的特異性是由其尾纖維與宿主細菌受體之間高度演化的結合相互作用所賦予的 1。研究人員假設 PVC 的特異性也由尾纖維（Pvc13）決定 1。
人工受體實驗的證據
為了研究 PVC 靶向特異性，研究人員首先構建了一系列人工 HEK 293FT 衍生細胞類型，這些細胞表達了可被工程化 PVCs 輕鬆靶向的明確非天然受體 1。為了簡化，他們選擇了一組針對商業表位標籤的抗體（scFvs 和奈米抗體）作為受體 1。然後，他們將相關的表位標籤插入到尾纖維（Pvc13 的氨基酸 403-476）的遠端結合域中，並將由此產生的修飾 PVCs 施用於這些「細胞類型」，以了解 PVCs 進行靶點選擇的效率 1。結果發現，重新靶向帶有表位標籤的 PVCs 僅能有效地將酬載遞送至表達相應結合夥伴的細胞中 1。這項結果表明，PVC 的特異性主要由尾纖維與其靶受體之間的相互作用所決定，並且這種相互作用可以被工程化以實現對新型細胞類型的特異性識別 1。
內源性受體（EGFR）實驗的證據
接下來，研究人員評估了 PVC 對 EGFR（一種在某些人類細胞類型中內源性存在的天然受體）的特異性 1。在該實驗中，他們測試了編程為靶向 EGFR 的 PVC 是否特異性靶向已知表達 EGFR 的細胞。他們發現，重新靶向抗 EGFR DARPin (E01) 並裝載毒素 (Pdp1 和 Pnf) 的 PVCs 僅能有效地殺死 EGFR 表達細胞系 (A549 和 A431)，而不能殺死 EGFR 陰性細胞系 (Jurkat 和 3T3) 1。此外，研究還發現，將 EGFR 轉染到先前實驗中的 EGFR 陰性細胞系 (3T3) 中，會使這些細胞對該 PVC 敏感 1。這表明適當靶受體的出現足以使細胞能夠進行 PVC 介導的遞送，進一步強化了其高度特異性 1。
這些結果，加上人工受體實驗的發現，提供了強有力的證據，證明 PVCs 表現出高度的靶點特異性，並且只能有效地將酬載遞送至表達合適靶受體的細胞中 1。
無論是人工受體實驗（表位標籤/抗體）還是內源性受體實驗（EGFR），都明確證明了 PVC 遞送具有高度特異性且依賴於受體。只有當工程化的尾纖維與細胞表面受體精確匹配時，遞送才會發生 1。所展示的特異性水平（例如，僅殺死 CD4+ Jurkat 細胞，而非 CD11b+ 細胞；僅在導入 EGFR 後才使 3T3 細胞敏感）對於治療應用至關重要。它最大限度地減少了對健康細胞/組織的附帶損害，這是許多當前療法（例如化療、某些基因療法）面臨的主要挑戰。人工受體系統是系統性驗證和設計新特異性的強大工具。這種高度的靶點特異性是開發安全有效精準醫療的基石。它允許將強效酬載（如毒素或基因編輯器）直接遞送至病變細胞，減少全身性副作用並提高治療指數。這一特性使 PVCs 成為需要對酬載去向進行精確控制的應用領域（如腫瘤學、自身免疫性疾病或高度局部化的基因療法，其中脫靶遞送可能有害）的優越替代品。它還為未來合理設計高度選擇性遞送載體提供了堅實的框架。
8. 更廣泛的應用與未來展望
本研究證明了 PVCs 作為一種多功能且高度可編程的蛋白質遞送工具，在多個領域具有廣闊的應用前景 1。
基因療法：
精準基因編輯： PVCs 能夠遞送 Cas9 以實現插入和缺失，以及遞送 ZFDs 以實現無引導 RNA 的鹼基編輯 1。
多樣化酬載能力： 能夠遞送 Cas9（170 kDa）等大分子蛋白質，擴展了治療選擇 1。
靶向遞送： 工程化特異性確保酬載到達目標細胞，最大限度地減少脫靶效應 1。
暫時性： 非常適合需要暫時性或短期蛋白質表達的療法，降低長期風險 1。
癌症療法：
特異性殺死癌細胞： 靶向遞送毒素至表達特定受體（例如 Jurkat 細胞上的 CD4）的癌細胞 1。
受體特異性細胞毒性： 精準性最大限度地減少對健康組織的損害 1。
多樣化毒素潛力： 模組化酬載裝載允許使用各種治療劑 1。
生物防治：
靶向特定生物體： 可重新編程以靶向非天然生物體，用於害蟲防治 1。
害蟲防治： 有望開發出針對農業害蟲或疾病載體的高度特異性和有效生物防治劑 1。
多重遞送策略： P. luminescens TT01 中天然存在的 PVC 陣列（Extended Data Fig. 9）表明，可以工程化 PVCs 以同時靶向多種害蟲或遞送不同的生物活性 1。
總體而言，PVCs 代表了一種多功能的可編程蛋白質遞送工具。它們在昆蟲細胞、人類細胞、原代細胞和活體小鼠中均展現出活性 1。這使得它們非常適合從生物防治到人類基因療法等多種應用 1。
本研究中反覆提及的「可編程」特性是其核心。它意味著一種理性、設計驅動的生物工程方法，超越了試錯法。天然的多重陣列（Extended Data Fig. 9）為設計多功能 PVCs 提供了令人信服的生物學先例（例如，單個 PVC 顆粒可同時靶向兩種不同的細胞類型，或同時遞送兩種不同的酬載）。這種固有的模組化以及結合不同「模組」（靶向器 + 酬載）的能力，使其真正成為一個平台技術。這項研究為蛋白質遞送建立了一個新的範式，提供了一個高度客製化和多功能的平台。它預示著未來治療干預可以精確地針對特定的疾病狀態或細胞類型進行量身定制，從而可能實現更有效和安全的治療。模組化還可以透過允許快速原型設計新的遞送策略來加速藥物發現和開發。這項工作不僅僅是一種新的遞送載體；它展示了一個強大的工程原理，可以應用於其他生物奈米機器，為合成生物學和醫學開闢了全新的途徑。
9. 結論
本研究成功開發了一種新型、高度可編程且特異性的蛋白質遞送平台——光桿菌毒力盒（PVCs）。透過精密的工程改造，該系統能夠裝載並遞送多樣化的蛋白質酬載，並精準靶向人類和小鼠細胞。尤為重要的是，體內研究證實了其優異的安全性和暫時性，為其未來的臨床應用奠定了堅實基礎。PVCs 的這些特性使其成為基因療法、癌症療法和生物防治等領域中具有變革潛力的工具，為靶向治療和生物技術的未來發展做出了重大貢獻。
引用的著作
s41586-023-05870-7.pdf
沒有留言:
張貼留言