( 原文在 https://www.nature.com/articles/s41467-024-45998-2 )
背景
CRISPR-Cas 技術改編自細菌免疫系統，已成為細胞和生物體基因組工程的革命性分子工具。在 RNA 成分 (sgRNA) 的引導下，Cas 蛋白利用其核酸內切活性在目標基因組位點產生雙股斷裂，誘導位點特異性 DNA 修復，進而將序列變化引入基因組。這種 RNA 引導的活性也用於引入位點特異性序列變化（鹼基編輯）和逆轉錄酶產生的序列變化（引子編輯）2。CRISPR-Cas9 基因組編輯技術已被用於治療遺傳性疾病。然而，擴大使用 CRISPR-Cas 技術作為一種療法將需要高效、安全的遞送方法來將編輯分子轉運到體內靶細胞中。特別是，將 CRISPR-Cas 複合物遞送至中樞神經系統 (CNS) 仍然是一個巨大的挑戰。目前的腦遞送方法包括顱內注射病毒載體，例如編碼Cas蛋白和相應sgRNA的腺相關病毒(AAV)。然而，病毒遞送可能具有免疫原性並誘導不必要的插入突變，且病毒載體的生產面臨製造困難。相反，CRISPR-Cas核糖核蛋白（RNP）的直接遞送（如果可用）可以避免病毒遞送系統的缺點。
進行 CRISPR 實驗時，可以由轉染或病毒方式 (Plasmid/Lentivirus) 送入 DNA，讓細胞自己表現 Cas9 蛋白和gRNA。另外一種方式是 Ribonucleoprotein (RNP) system，直接送入 Cas9 蛋白和 gRNA 進入細胞，因此為 DNAfree 系統，可避免外源 DNA 嵌入細胞染色體，降低突變機率。( 原文 https://www.omicsbio.com/userfiles/files/2020Q3-CRISPR%E5%85%A8%E7%94%A2%E5%93%81.pdf )
將 CRISPR-Cas RNP 遞送至大腦尤其令人感興趣，因為它有可能誘導基因組編輯，從而預防神經退化。非病毒遞送策略已採用不同類型的奈米顆粒來封裝 CRISPR-Cas9 或 -Cas12a RNP，例如「CRISPR-Gold」系統 、具有兩親性胜肽的奈米複合物、聚乙二醇化奈米膠囊和葡萄糖綴合的二氧化矽奈米顆粒。這些例子表明，不同的細胞類型可以以不同的效率進行編輯，其中一些足以改善小鼠模型的疾病病理學。然而，這些遞送方法嚴重依賴奈米顆粒的最佳化和製造，這可能限制它們的治療應用。或者，細胞滲透性 Cas9 RNP 可以為體外和體內基因組編輯提供更簡單、更廣泛適用的策略。具有穿透細胞膜能力的胜肽可用於賦予Cas9自我遞送能力。先前的工作表明，與多個帶正電荷的核定位序列（SV40 NLS）融合的 Cas9 RNP 能夠自我遞送至小鼠神經元，用於基因組編輯目的。最近的研究表明，合成設計的內體溶解胜肽可以有效促進 Cas9 RNP 以非共價方式在體外遞送至原代細胞。因此，我們假設 Cas9 和高功能 CPP(细胞穿透肽 ) 的基因融合工程將幫助我們建立具有（靶向）自我傳遞能力的強大 RNP，特別是對於體內基因組編輯。
在這裡，我們描述了細胞滲透性 CRISPR RNP 的開發，用於在體外遞送至神經祖細胞和體內神經元。對與不同細胞穿透胜肽(CPP)融合的 Cas9 進行篩選和系統工程鑑定出一種能夠有效自我傳遞和基因組編輯的有效構建體。使用這種自我傳遞方法來編輯小鼠大腦中的臨床相關基因，證明了該方法在治療中樞神經系統遺傳性疾病方面的潛在用途。
貢獻
與其他遞送方法相比，用於體外和體內基因組編輯的 CRISPR 核糖核蛋白 (RNP) 遞送具有重要優勢，包括減少脫靶和免疫原性效應。然而，由於效率低和細胞毒性，RNP 的有效遞送在某些細胞類型中仍然具有挑戰性。為了解決這些問題，我們設計了可自我交付的 RNP，它可以促進有效的細胞攝取並進行強大的基因組編輯，而無需輔助材料或生物分子。篩選與 CRISPR-Cas9 蛋白融合的細胞穿透胜肽 (CPP)，鑑定出能夠對神經祖細胞進行有效基因組編輯的有效構建體。這些融合蛋白的進一步工程化建立了 C 端 Cas9 與三個 A22p 拷貝的融合，A22p 是一種源自人類 semaphorin-3a 的胜肽，與其他構建體相比，其顯示出顯著改善的編輯功效。我們發現，當直接注射到小鼠紋狀體時，可自我傳遞的 Cas9 RNP 會在臨床相關基因中產生強大的基因組編輯。整體而言，可自我傳遞的 Cas9 蛋白為體外和體內基因組編輯提供了一個簡單有效的平台。
